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Protein A纯化工艺过程中的蛋白聚集

金沙4166手机官网 日期:2018-03-22 08:56:13

转自 刘华杰   Bioprocess

 

      生物制药行业的快速发展,使得大规模工业化生产技术已经变得比较成熟,包括上游细胞发酵工艺和下游纯化制剂工艺。但这些工艺过程中仍然面临一些挑战,比如如何使产品在工艺开发过程中遇到极限条件时不发生降解,保持性能稳定。蛋白降解不仅是向小分子方向的降解,聚合体的产生也是降解的一种形式。在最终生物制剂中,蛋白产品中的聚体被界定为杂质,并且需要将其控制到一定水平。因为聚体的形成是造成免疫原性的原因之一,同时还可能会影响产品效力和重现性。

      目前普遍采用的抗体纯化工艺包括:用protein A亲和层析法来做为第一步捕获和浓缩IgG分子;在IgG与protein A 结合后,通过降低pH(常用的洗脱缓冲液是0.1M柠檬酸钠,pH3.3)将IgG分子从protein A上洗脱下来;然后低pH值保持一段时间进行病毒灭活;再采用碱性缓冲液进行中和。然而,对于大多数抗体来说,低pH的酸性条件和pH的骤变往往会导致蛋白聚合。目前已经有不少报道关于低pH可以诱导蛋白聚合,而且低pH是从protein A上洗脱时发生聚合的一个关键原因;高浓度条件下蛋白也易发生聚合,此外蛋白自身的吸附和解吸附作用也可能有很大的作用。

 

蛋白聚合的一个典型模型包括5个阶段(见下图)

 

 

由天然的稳态结构发生可逆的构型转变形成活性单体(RM);
两个或更多的RM形成可逆的或不可逆的聚合状态;
由聚合状态不可逆的形成一个聚体核;
更多RM或小的低聚物结合到核上形成规则或是不规则的聚合体;
聚体和聚体之间通过交联,侧联等形成胶体,纤维状,或是可见的沉淀颗粒

 

      虽然目前对于哪个阶段是限速步骤还有争论,但是第一阶段由天然稳态构象转变成为活性不稳定构象是这个过程的起始。低pH对构象产生的影响通过DSC检测也可以发现。如在pH6.0,可以观察到两个主要的吸热转换;pH 3.5时相似的转换在相对低温条件下也会发生;pH2.7 时观察到一个明显不同的吸热转换,而且这个转换在相对低温条件下也可发生。

      Shukla等曾尝试研究低pH、蛋白浓度和色谱柱纯化对FC-融合蛋白的聚合影响。在低pH值条件下,protein A 纯化显著增加高分子量聚合物的速率常数。另外,不同的添加物包括洗脱液都可以改变聚集速率。一些色谱柱实验还显示,本是促进蛋白稳定的添加物在低pH值条件下反而变成降低蛋白稳定的因素。此外,也有实验显示洗脱时添加精氨酸可以阻止蛋白聚合。最近Gagnon等研究表明,将IgG1从Protein A 上洗脱时对蛋白构型有影响,因为其流体动力学半径减少和二级结构发生变化,但是仅在低pH条件下不经过洗脱过程时,这种现象不存在。

      Protein A 结合到IgG的Fc 片段介于CH2和CH3区之间的区域。1个Protein A含有5个和抗体IgG分子Fc段特异性结合的结构域,可以结合至少两个IgG分子。Fc段可以特异性结合Protein A 区域也可以绑定一些其他分子,因此又被称为共识结合位点(consensus binding site, CBS)。CBS 一定程度上具有疏水性,只含有相对较少的极性残基。这些特性包括疏水残基的内陷、静电相互作用和氢键结合力等都能促进其绑定能力。根据Delano等的解释,CBS结合到一个配基的时候会经历一个相当大的构象变化。实际上,构象变化与配基本身有关,他强调了该区域的柔韧性,该柔韧性即是在发生构型改变后具有好的结构恢复性,但在恶劣环境条件下如低pH条件下对结构改变具有很大损伤。Deisenhofer通过X射线晶体学发现,与不绑定FC相比,结合片段B的CH2区域的紊乱加剧。相反,有些IgG分子从Protein柱上洗脱下来后保持折叠状态,尽管这种状态与它起始状态不同,该现象归结于低pH样品在中和时剧烈的pH变化引发了构象紊乱。

 

低pH对聚体产生的影响
      本文采用IgG4做为研究对象,为了检验抗体浓度和低pH对聚体产生的影响,使用0.15M的glycine–HCl溶液稀释IgG4至一系列浓度和pH范围:0.9mg/L-4.5mg/L, pH 2.78- pH 3.03。pH按照Henderson–Hasselbalch估算调节后进行实际的测定,后期不再进行调整。放置不同时间进行取样,取样后用10%体积的0.8M的Tris-HCL(pH 8.45)进行中和。中和后的样品4℃过夜储存后进行SEC分析。对照是采用SEC buffer 稀释IgG至各种浓度。采用下面的方程式分析单体回收率百分比:
R=AS/AC*100
      其中R是回收单体百分比。AS和AC分别代表样品单体和对照单体的峰面积。回收的单体百分比用来计算单体损失率。结果如下图所示:

 

 

      从上图可以看出,IgG4对一定范围内的pH高度敏感。当pH值低于2.8时,单体聚和速度很快;到达平台期的时间少于30min。然而,当pH值高于3.0时到达平台期的时间接近4h。这里的平台期并不是单体完全消失的点,而且平台期会根据pH值条件发生变化。平台期可看做是单体与不同程度上的聚合体的可逆平衡。因为将从起始聚合体中纯化出来的单体重新置于低pH条件下,该条件与起使实验时的条件一致,发现纯化出的单体仍然会发生聚合,并且就聚合特性来说与起始单体类似。这个结果支持了平衡机制的理论。

      此外,在较大的IgG4浓度范围内,实验显示抗体浓度与聚合体动力学并没有明显的关系,而且对平台期的影响也没有明显的趋势。因此,我们假设聚合体平台具有pH依赖性,是在单体、未折叠和再折叠的单体之间的平衡。

 

Protein A色谱柱对IgG4形成聚体的影响
      对IgG4的Protein A纯化如下图所示,色谱柱实验时开始有光吸收的时间认为是t0,并假定该点抗体已经开始接触洗脱液。起始洗脱出的样品pH值高于3,洗脱快结束时流出液的pH才接近洗脱缓冲液。

 

 

      本实验采用Fraction 3的样品进行分析,在洗脱后的不同时间,采用pH缓冲液进行中和,然后用SEC缓冲液稀释进行分析。单体回收率采用上述方法。

 

 

      上图显示不同pH条件下,色谱柱实验和缓冲液实验中的单体损失率随着时间的变化。实心标记和实线显示的是仅在低pH缓冲液中的结果,空心标记和虚线显示的为过Protein A后,在低pH下维持不同时间后的结果(a,b,c);d为色谱实验中结果汇总。从图中可看出,色谱纯化这一步骤并没有对聚合体形成造成太大影响,但确实是加速了这一进程。

 

根据实验结果得到几个结论
1、IgG4具有明显的高度pH值依赖性和明显的浓度非依赖性的聚集行为,根据这一现象,推测该聚合现象主要以pH依赖的解聚/再折叠平衡状态存在。

2、色谱柱纯化过程加快蛋白聚合的速度,而理论上影响蛋白聚合的其他因素本次实验显示基本没有作用。据此推测其可能有一种分子机制:即蛋白的构象发生了变化,和环绕蛋白周围的水化层发生变化一样,同样是蛋白吸附和随后的解吸附所需,改变了蛋白结构,有可能使蛋白暴露区域发生了解折叠转化。在这种条件下,立即暴露在酸性环境中可以增加蛋白解折叠的可能,当维持在该pH条件下时,在蛋白形成聚合物之前会使蛋白一定程度上丧失本体结构。

3、本实验用的是protein A 色谱柱纯化末尾的洗脱液。刚开始的洗脱流出液的pH值高聚合的可能性较小。而洗脱峰尾可能代表一种单体亚群,其对配基具有高度亲和力。与早洗脱锋相比,该类单体可能具有高度的结合能力,致其在吸附和解吸附过程中结构更容易发生紊乱,进而使聚合速率加快。

 

参考文献
Roberts, C. J. (2007). Biotechnol Bioeng 98(5): 927-938.
Mazzer, A. R., et al. (2015). Journal of Chromatography A 1415: 83-90.

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